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Ultra-Violets
et Mélanome |
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Protocole L’expérience
se déroule en deux séances : 1e
séance : - Mise en suspension de colonies de levures
prélevées sur une boîte de pétri. - Comptage
sur lame et dilution afin d’obtenir une suspension de levures de
concentration connue. - Etalement sur milieu. - Irradiation aux UV à 254 nm. - Incubation à 28° C. 2e
séance, une semaine plus tard : - Observation
et interprétation des résultats. Matériel :
- Souche de
levures : saccharomyces cerevisae sur boîte de pétri. -
Milieu : gélose à couler. - 5 boîtes de
pétri stériles. - 2 étaleurs
stériles. - 5 tubes à
essai stériles. - 2 pipettes
stériles de 5 ml. - 2
cure-dents stériles. - 1 lame de
dénombrement. - 1 boîte
d’irradiation. Conditions
de travail : - Nettoyage
de la paillasse à l’alcool. - Travail
dans un rayon de 30 cm autour de la flamme d’un bec bunsen. - Mains
passées à l’alcool, port d’une blouse en coton. - Instruments
et milieux stérilisés ouverts et utilisés autour de la flamme. - Pot avec
javel pour récupérer les pipettes usagées. - Noter au
marqueur indélébile au dos des boîtes le numéro de la préparation. Matériel
biologique : La levure saccharomyces cerevisae Ade2 est un champignon
eucaryote unicellulaire haploïde. C’est le plus petit génome eucaryote
connu : 6200 gènes. La souche utilisée porte une mutation qui affecte le
gène Ade2 impliqué dans la chaîne de biosynthèse de l’adénine. Le gène Ade2 a
pour fonction de transformer un intermédiaire de cette chaîne : l’Amino
imidazole ribotide ou AIR qui se transforme en un pigment rouge par
aérobiose. La mutation
Ade2- a deux conséquences : - La souche
étant incapable de synthétiser l’adénine, elle ne poussera pas sur un milieu
minimum. - Si on lui
apporte de l’adénine et en supplémentant le milieu de culture, elle va
l’utiliser et présentera un phénotype rouge du fait de l’accumulation de
l’AIR. Ce phénotype rouge nous permet de
disposer d’un « crible
positif » visible à l’œil nu. On différencie ainsi facilement les
souches qui portent la mutation Ade2- après croissance sur boîte
de pétri. Agent
mutagène : La molécule d’ADN possède la propriété d’absorber la lumière
UV à 254nm. Le rayonnement UV entraîne des mutations. L’absorption de l’énergie des UV par l’ADN entraîne la
formation de dimères de thymines adjacentes, ce qui provoque des cassures au
sein de la molécule due à des distorsions de la double hélice. Dans la
majorité des cas, ces cassures vont êtres réparées par les enzymes impliquées
dans la réplication de l’ADN. Cependant, ces enzymes peuvent commettre des
erreurs et des mutations peuvent apparaître. Plus on sollicite ces enzymes,
plus le risque d’apparition de mutations est important. Ces mutations peuvent
être létales (si elles affectent un gène responsable de la synthèse d’une
protéine vitale) ou non, et dans ce cas, entraîner l’apparition d’un mutant. La manipulation consiste à exposer notre souche aux UV et
observer l’apparition de révertants de couleur blanche. L’introduction d’une
mutation dans un gène en amont d’Ade2 dans la chaîne de biosynthèse de
l’adénine empêche l’accumulation de l’AIR : c’est un révertant.
L’introduction d’une seconde mutation dans le gène Ade2 peut rétablir sa
fonction, dans ce cas la levure peut à nouveau synthétiser l’adénine et
n’accumule plus l’AIR, donc sera blanche : on dit qu’on a un révertant
vrai, celui-ci poussera alors sur un milieu minimum. L’introduction
d’une mutation dans un gène impliqué dans la chaîne respiratoire empêche la
transformation de l’AIR en pigment rouge, car c’est un phénomène aérobiose. Protocole : -
Reconstitution des milieux de culture -
Préparation d’une suspension de levures Verser 10mL d’eau distillée
stérile dans un tube stérile à l’aide d’une pipette stérile. Avec un
cure-dents stérile, prélever quelques colonies de levures isolées sur boîte
de pétri, mettre en suspension dans les 10mL d’eau puis agiter. Continuer
jusqu’à l’obtention d’une solution trouble. La solution obtenue est la
solution mère. Avec un compte-gouttes stériles,
prélever 0.5mL de la solution mère, verser dans un tube stérile et compléter
jusqu’à 5mL avec de l’eau stérile. - Comptage Chaque lame de comptage comporte
10 cupules individuelles de comptage à grille quadrillée de 81 petits
carrées. Le volume tenu sur une grille est de 0.81μL. Avec un compte-gouttes stérile,
prélever une goutte de solution de comptage préalablement agitée (dilution au
1/10 de la solution mère) et déposer dans le coin d’une cupule de
comptage ; par capillarité, la solution va pénétrer sous la lamelle
Placer alors la lame sous l’objectif du microscope au grossissement 400,
régler la mise au point, puis compter les levures présentes dans une dizaine
de carrés de comptage. Faire une moyenne (nombre de levures par carré de
comptage), puis multiplier la moyenne par 105 pour trouver le nombre
de levures par mL. On souhaite préparer une solution
A de concentration 106 levures/mL. Après calculs, on trouve qu’il
faut prélever 4mLde la solution mère et ajouter 6 mL d’eau distillée. On
prépare également une solution B de concentration 105 levures/mL
en diluant 10 fois la solution A. Avec un compte-gouttes, verser 0,1 mL de la solution B sur une
boîte de milieu, puis étaler immédiatement avec un étaleur stérile, d’un
mouvement circulaire et répété, afin de répartir le mieux possible la
solution sur le milieu. La première boîte ne sera pas soumise à l’action des
UV, elle sera notée I0. Avec l’autre compte-gouttes, déposer 0,1
mL de la solution A préalablement agitée sur les 4 autres boîtes de milieu,
puis étaler immédiatement avec l’étaleur, comme précédemment. Les boîtes sont
alors prêtes à être irradiées, on les notera I1, I2, I3,
I4. Irradiation Ouvrir la
porte de la boîte d’irradiation, puis placer la boîte I1 sous la lampe.
Enlever le couvercle et le placer à l’envers à côté de la boîte I1.
Refermer la porte et allumer la lampe. Au bout de 15 secondes, éteindre la
lampe et replacer le couvercle. Faire de même pour les boîtes : I2
(30 secondes), I3 (1 minute), I4 (2 minutes). Incuber les 5
boîtes cinq jours, à 28° puis conserver au réfrigérateur, jusqu’à la séance
d’observation des résultats. |
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